Rilevamento rapido delle varianti SARS-CoV-2, uno strumento chiave per la sorveglianza pandemica

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ambientazione e disegno

Questo studio osservazionale è stato condotto presso l’Hospital Universitario 12 de Octubre (Madrid, Spagna), che è un ospedale terziario di riferimento per l’analisi delle varianti SARS-CoV-2. Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki, rivista nel 2013. Non è stata necessaria l’approvazione di un Comitato etico della ricerca, come stabilito dalla Legge organica 3/2018, del 5 dicembre, sulla protezione dei dati e la garanzia del digitale Informazione. Diritti. Tale legge consente alle autorità sanitarie e alle istituzioni pubbliche con poteri di vigilanza sanitaria pubblica di svolgere attività di ricerca scientifica senza il consenso dell’interessato in situazioni di eccezionale rilevanza e gravità per la sanità pubblica.

Nel 2021, l’analisi della variante SARS-CoV-2 è stata eseguita in modo prospettico sulla maggior parte dei campioni positivi iniziali, a seconda del numero di campioni positivi ottenuti durante le ondate di picco e della disponibilità dei reagenti. Il rilevamento delle varianti è stato eseguito su campioni raccolti da reparti di emergenza, operatori sanitari, ricoveri e tre centri di assistenza primaria designati come siti sentinella dalle autorità sanitarie pubbliche locali, per un totale di 22 settimane (da 1 a 11 settimane). , da 28 a 37 e 50 a 52). ). Durante le restanti 30 settimane (settimane 12-27 e 38-49), il rilevamento delle varianti è stato eseguito su tutti i campioni inizialmente positivi..

procedure di studio

L’analisi delle varianti SARS-CoV-2 mediante RT-PCR è stata eseguita utilizzando vari test diagnostici a seconda della loro disponibilità e utilità per rilevare le varianti emergenti. I reagenti utilizzati durante lo studio sono descritti nella Tabella 1.

Tabella 1 RT-PCR e analisi di sequenziamento dell’intero genoma e metodi di estrazione dell’RNA utilizzati durante le settimane del 2021 in base all’emergere di nuove varianti preoccupanti e alla disponibilità di reagenti.

I risultati sono stati interpretati come segue: variante alfa (abbandono del gene S o positività per N501Y e H69/V70); Beta/Gamma (positivo per N501Y e E484K); Delta (positivo per L452R); e Omicron (positivo per N501Y, da H69/V70 e K417N).

Il sequenziamento dell’intero genoma (WGS), considerato la tecnica gold standard, è stato eseguito su campioni che erano stati precedentemente testati per varianti mediante RT-PCR e avevano un valore Ct < 25. La decisione di eseguire WGS dipendeva anche dal numero di campioni positivi ottenuto. durante le onde di picco e la disponibilità di reagenti. Di conseguenza, il WGS è stato eseguito sul 10,8% dei campioni sottoposti ad analisi della variante SARS-CoV-2 mediante RT-PCR. Inoltre, quando non era possibile eseguire il WGS su tutti i campioni precedentemente analizzati mediante RT-PCR (durante le onde di picco), la selezione del campione per il WGS si è basata su criteri casuali. Questo processo di selezione ha garantito la rappresentazione di una serie diversificata di campioni. Il WGS è stato eseguito dal campione originale utilizzando le piattaforme Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) o ABL SA Group (Lussemburgo/Illumina, San Diego, CA, USA), a seconda della disponibilità dei reagenti (Tabella 1). Entrambi i metodi hanno seguito il protocollo di sequenziamento ARTIC nCoV-2019.⁷. Nello specifico, per la piattaforma Ion Torrent, l’identificazione delle basi, il clipping e il controllo di qualità sono stati eseguiti utilizzando la pipeline integrata nel software Ion Reporter. Le letture sono state quindi mappate al genoma di riferimento Wuhan-Hu-1 (numero di accesso GenBank: MN908947.3) utilizzando l’assemblatore IRMA.⁸ Plug-in del software Ion Reporter (ThermoFisher Scientific, Carlsbad, CA, USA). La chiamata alle varianti è stata eseguita in parallelo con il plug-in Variant Caller del software Ion Reporter e con Snippy v.4.6.0⁹, con le impostazioni predefinite (10 volte la copertura minima e il 90% della frequenza allelica minima). Le annotazioni delle varianti erano basate sul genoma di riferimento. Il plug-in Variant Caller è stato utilizzato anche per cercare varianti minori. Per filtrarle, le letture sono state mappate al ceppo di riferimento utilizzando il software Geneious Prime (versione 2020.0.4, Biomatters Ltd., Nuova Zelanda) e le varianti sono state verificate manualmente rispetto alle formazioni. Sono state scartate tutte le varianti con bassa copertura, presenti in meno del 15% delle letture, situate vicino agli estremi delle letture (ampliconi) o con bassa qualità di lettura. Le varianti identificate come problematiche da De Maio et al.¹⁰ sono stati anche demoliti. Per la piattaforma ABL, sono state eseguite diverse fasi della pipeline utilizzando il software MicrobioChek (ABL Group SA, Lussemburgo).^undici. I lignaggi sono stati assegnati seguendo lo schema PANGO.¹² e utilizzando l’applicazione web Pangolin 2.0¹³e lo schema delle lettere dell’anno di NextStrain sul sito web di NextClade¹⁴. Tutte le sequenze SARS-CoV-2 sono state depositate nel database GISAID^quindici (codice: h-CoV-19/Spagna/MD-H12O).